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本试剂盒适用于从各种植物细胞和实体组织中提取磷酸化蛋白。提取过程简单方便，可在1小时内完成。本试剂盒含有的独特配方能有效溶解细胞膜组份，包括细胞质膜、核膜和各种细胞器膜。本试剂盒含有的蛋白酶抑制剂混合物，阻止了蛋白酶对蛋白的降解，为提取高纯度的蛋白提供了保证。

本试剂盒提取的蛋白为具有天然蛋白构象的活性蛋白。本试剂盒中不含有EDTA，与金属螯和层析等下游应用兼容。本试剂盒提取的蛋白可用于WB、蛋白质电泳、免疫沉淀、ELISA、转录活性分析、Gel shift凝胶阻滞实验、酶活性测定等下游蛋白研究实验。

本试剂盒对磷酸化蛋白的磷酸化状态保护极佳，完全阻止磷酸化蛋白的降解。本试剂盒不是特异性纯化磷酸化蛋白的试剂盒。

本试剂盒提取的蛋白样本含有高浓度的盐成分，不可直接用于2D电泳，如下游实验需要直接用于等电聚焦、双向电泳，请使用我司其他货号的试剂盒。也可以将最后样品除盐后再用于2D电泳，用脱盐柱脱盐处理（货号HR0389）。

• 使用方便，从细胞，提取蛋白不需经过研磨、反复冻融、超声破碎等前处理。
  
• 将蛋白提取的时间缩短至30分钟～1小时。
  
• 含蛋白稳定剂，提取的蛋白稳定。
  
• 紫外检测蛋白浓度时，背景干扰低。
  
• 蛋白酶抑制剂抑制了蛋白的降解，蛋白酶抑制剂配方优化。蛋白酶抑制剂混合物包含7种独立的蛋白酶抑制剂；每一种抑制剂可特异性抑制某一种或几种蛋白酶活性。该混合物优化的组成使其可以抑制几乎所有重要的蛋白酶活性，包括丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、丙氨酰-氨基肽酶等。

• 蛋白酶抑制剂未开盖使用前也可以2～8℃储存。开盖使用后-20℃储存。
  
• 蛋白酶抑制剂在2～8℃时是固体状态，从冰箱取出后恢复至室温或37℃短时间水浴，变成液体状态后离心至管底部再开盖。

• 旋帽离心管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体甩至管底，避免开盖时液体洒落。
  
• 实验过程中的所有试剂须预冷；所有器具须放-20℃冰箱预冷。整个过程须保持样品处于低温。
  
• 蛋白酶抑制剂储存期间溶液如果出现沉淀，不影响使用，溶解后正常使用。

• 植物组织样本：
  
  • 提取液准备：
    每500μL冷的提取液A中加入2μL蛋白酶抑制剂混合物，混匀后置冰上备用。
    注：
    ● 根据需要处理的样品数量准备蛋白提取液，蛋白酶抑制剂混合物不可以一次全部加入提取液。
    ● 加过蛋白酶抑制剂的提取液一周内未使用完，再次使用前需要再次加入蛋白酶抑制剂。
    ● 以下步骤中使用的蛋白提取液为此步配制好的含蛋白酶抑制剂的提取液。
    
  • 取洗净擦干后并去除叶梗和粗脉的100～200mg鲜嫩植物组织样本用手术刀尽可能剪碎，加入500μL提取液A后用匀浆机/匀浆器充分匀浆。
    注：
    ● 也可置于研钵中用液氮研磨，研磨后加入500μL冷的提取液A。
    ● 没有液氮研磨条件，也可加入500μL提取液A直接置冰上研磨。
    
  • 将匀浆液吸入一个预冷的干净离心管中在4℃振荡30分钟～1小时。
    注：
    ● 使用振荡器/摇床的较低转速，提取液能轻微晃动即可。
    ● 没有振荡条件也可以不振荡，静置1小时，中间每隔10分钟充分混匀一次。
    
  • 在4℃,12000×g条件下离心10～15分钟。
    
  • 将上清吸入另一预冷的干净离心管，即可得到植物磷酸化蛋白。
    
  • 上述蛋白提取物请分装后于-80℃冰箱保存备用或直接用于下游实验。
    注：
    ● 建议用BCA方法进行蛋白定量。相关产品：HR0329。
    ● 蛋白样品-80℃存放一年没问题。注意不要被蛋白酶水解掉，不要被细菌污染。
• 细胞样本：
  
  • 提取液准备：
    每500μL冷的提取液A中加入2μL蛋白酶抑制剂混合物，混匀后置冰上备用。
    注：
    ● 根据需要处理的样品数量准备蛋白提取液，蛋白酶抑制剂混合物不可以一次全部加入提取液。
    ● 加过蛋白酶抑制剂的提取液一周内未使用完，再次使用前需要再次加入蛋白酶抑制剂。
    ● 以下步骤中使用的蛋白提取液为此步配制好的含蛋白酶抑制剂的提取液。
    
  • 细胞用PBS洗涤2次。
    
  • 加入细胞体积5～10倍体积的蛋白提取液，振荡1小时。
    
  • 在4℃,12000×g条件下离心10～15分钟。
    
  • 将上清吸入另一预冷的干净离心管，即可得到植物磷酸化蛋白。
    
  • 上述蛋白提取物请分装后于-80℃冰箱保存备用或直接用于下游实验。
• 冻存样本：
  
  • 冻存组织样本参照上述组织样本步骤操作。
    
  • 冻存细胞样本中直接加入5～10倍体积的蛋白提取液，振荡30分钟。
    
  • 在4℃,12000×g条件下离心15分钟。
    
  • 将上清吸入另一预冷的干净离心管，即可得到植物磷酸化蛋白。
    上述蛋白提取物请分装后于-80℃冰箱保存备用或直接用于下游实验。

• 蛋白浓度低？
  处理部分组织样本时可能没有裂解完全，导致蛋白浓度低。只要适当延长试剂A的处理时间即可。最好在持续振荡的条件下处理，没有振荡器也可间隔几分钟用吸头吹打混匀。
  
• 用什么方法定量蛋白？
  建议用BCA法。不适合用Bradford法，因为试剂中含有干扰Bradford法的组份，导致定量不准。如果已经进行过透析处理或者用脱盐柱改换过缓冲体系，则可以用Bradford法定量。
  
• 提取时出现胶状沉淀？
  蛋白提取液处理产物中有事会出现少量透明胶状物，属正常现象。该透明胶状物为含有基因组DNA等的复合物。不检测和基因组DNA结合特别紧密的特定蛋白的情况下，可以直接离心取上清进行后续实验即可；如果需要检测和基因组结合特别紧密的核蛋白，则可以通过超声处理，300w/10s间隔10s，超声3分钟，随后离心取上清用于后续实验。
  
• 提取的蛋白具有活性吗？
  本试剂盒不含有离子型去垢剂组份，不破坏蛋白的结构，没有对蛋白质之间原有的相互作用的破坏，蛋白均保持其天然构象和活性。